A MON 810 kukorica genetikai háttere és ehhez kapcsolódó ökotoxikológiai kockázata

Genetic background and ecotoxicological aspects of MON 810

Summary
Currently, the majority of cultivated genetically modified (GM) plants in the agricultural industry in Europe has originally been developed in North America (USA and Canada) and are widely applied also in South America. Genetic modifications are used for three major aims: (a) introduction of a new property into an organism, (b) overexpression of a target gene product, and (c) silencing or functional studies of a specific gene by its inactivation in the host organism. The primary aim in case of MON 810 was the introduction of a novel property. A truncated version of Cry1, a toxin originating from Bacillus thuringiensis subspecies, highly effective against the European corn borer, was targeted to be expressed in GM maize. Thus, a vector containing the truncated Cry1 toxin gene and the corresponding regulating regions have been introduced into corn species using the gene gun transformation method. It is often claimed to be a benefit of MON 810, that its protecting action is persistent and the active compounds are shielded from harmful environmental effects. At the same time these advantages are disadvantages as well, since Cry1 toxin production is not tissue and period specific, therefore lacking basic requirements for the concept of integrated plant protection. Furthermore, the expressed Cry1 toxin is retained for a long duration in the environment, thus increasing its pressure. Currently the European Union is in the waiting state regarding MON 810 corn varieties and in many countries moratoria have been announced against cultivation.

Világszerte a termések 30-40%-a elveszhet a kártevők hatására a termesztés, szállítás és tárolás során. E nehézség megoldásaként főként különböző növényvédő szereket használnak. Viszont e vegyszerek általában szennyezik a környezetet és nem minden esetben specifikusak. E gond kezelésére kezdtek el genetikailag módosított (GM) növényeket létrehozni. Az elsőgenerációs génmódosítások során az adott növényfajba rendszertanilag távoli szervezet génjét (transzgén) ültettek be. A legtöbb, a mezőgazdaság számára így létrehozott elsőgenerációs GM-növény gyomirtószer-tűrő (ezen belül leggyakraban glyphosate- vagy glufosinate-tűrő), valamivel kisebb hányaduk pedig a Bacillus thuringiensis egy vagy több Cry toxin termelésért felelős génjét hordozza, valamint számos több transzgént is tartalmazó, a fenti tulajdonságokat együttesen tartalmazó (stacked event) fajtát is létrehoztak.

A B. thuringiensis spóraképző Gram-pozítiv, pálcika alakú baktérium. Az 1920-as évektől kezdve az egyes patovariánsai által termelt endotoxinokat (olyan baktériumok által termelt toxinokat, melyeket a baktérium nem a külvilágba választ ki, hanem a saját sejtjében tárol el) rovarölő szerként alkalmazzák. A B. thuringiensis által termelt delta-endotoxin közvetlenül az endospórával szemben (parasporális test) raktározódik el, és két fő csoportja ismert, a Cry és a Cyt toxinok. A Cyt toxinokat a növényvédelemben nem alkalmazzák citolítikus és hemolítikus hatásuk miatt. A Cry toxinokat aminosavszekvenciájuk alapján 22 főtípusba sorolták, ezen belül több altípusuk ismert. Gyakorlati szempontok alapján öt Cry toxin jelentős: Cry1 a lepkék hernyóira, Cry2 a lepkefélékre és kétszárnyúakra, Cry3 a bogarakra, Cry4 a szúnyogok láváira, míg a Cry5 toxin csoport a fonálférgekre toxikus [Bravo 1997; Takács és mtsai 2009]. Napjainkban is kereskedelmi forgalomban vannak fermentált B. thuringiensis alapú termékek, kristályos toxinfehérjéket tartalmazó rovarirtó szerekként (például Dipel WP). A B. thuringiensis Cry toxinjai protoxin formában termelődnek meg, és csak a rovarok emésztőrendszerében aktiválódnak, proteázok hatására. Ezzel ellentétben a MON 810-es kukorica által termelt Cry1Ab toxin egy már kurtított, tehát preaktivált forma [Székács et al 2010, Darvas és Székács, 2010].

A MON 810-as kukorica előállításához integratív vektorokat alkalmaztak, a vektorokat úgy tervezték meg, hogy azok a kromoszómától függetlenül ne legyenek képesek replikálódni a növényben. A transzformációhoz a szükséges vektorok – PV-ZMBK07 és PV-ZMGT10 – keverékét használták. A PV-ZMBK07 vektor a B. thuringiensis var. kurstaki (Btk) HD-1 törzsből származó cry1Ab gént tartalmaz, mely a karfiol-mozaikvírus (CaMV) 35S promóterének és a kukorica hsp70 (hősokkprotein) génjének szabályozása alatt áll. A cry1Ab gént követően a nopalin-szintáz (NOS) génjének nem átíródó régiója található 3′ irányban, mely transzkripciós terminátorként funkcionál, és irányítja a poliadenilációt. A CaMV 35S promótere konstitutív promóter, mely folyamatosan bekapcsolva tartja a gént, ezáltal a lektin típusú toxin átíródása folyamatos, ellentétben a kukorica összes többi génjével, melyek kifejeződéséhez adott körülmények megléte szükséges. A cry1Ab gén terméke a Cry1Ab toxin folyamatosan keletkezik a növényi sejtben. Ez több veszélyt is rejt magában. Egyrészt nem tudni, hogy a folyamatos toxintermelés miként meríti ki a sejt készleteit, ezáltal akár más fontos funkciók gátolódhatnak. Másrészt a promóter néha nemcsak a transzgént kapcsolja be, hanem a sejt saját génjeiből is néhányat, melyeknek termékére a sejtnek nincs szüksége, esetleg káros is lehet. Számos kutatási eredmény támasztja alá, hogy a CaMV 35S promóter beépülése a DNS-ben úgynevezett „forró-pontokat” (hot-spots) hoz létre, mely azt eredményezi, hogy az adott DNS-szakasz vagy akár az egész kromoszóma instabillá válhat [Ho et al 1999]. Lényeges szempont az is, hogy a CaMV nem szövetspecifikus promóter, vagyis a cry1Ab gén terméke minden egyes növényi szövetben, szervben kifejeződik, még ott is, ahol nincs szükség rá, például a gyökérben. A PV-ZMGT10 vektor a Gox és CP4 expressziós kazettákat tartalmazza. A gox-gén expressziós kazetta a következő elemeket tartalmazza: karfiol-mozaikvírus 35S promóter (E35S); kukorica hsp70 gén; CTP1 – az Arabidopsis thaliana ribulóz-1,5-difoszfát-karboxiláz/oxigenáz (rubisco) enzimének kis alegységéhez kapcsolodó kloroplasztisz-tranzitpeptid génje – mely a célprotein transzfehérjét hivatott irányítani a citoplazmából a kloroplasztiszba; gox gén, glyphosate-oxidoreduktáz enzimet kódoló génszakasz az Achrobacter sp. LBAA törzséből, mely a glyphosate lebontásáért felelős; végül a NOS 3′ terminátor, mely transzkripciós terminátorként funkcionál, és irányítja a poliadenilációt. Emellett a PV-ZMGT10 vektor tartalmazza a CP4 expressziós kazettát: karfiol-mozaikvírus 35S promóter (CaMV 35S); kukorica hsp70-gén; CTP2 – az Arabidopsis thaliana 5- enolpiruvil-sikimin-3-foszfát-szintáz (EPSPS) enzimhez kapcsolodó kloroplasztisz-tranzitpeptid, mely a célprotein transzferjét hivatott irányítani a citoplazmából a kloroplasztiszba; EPSP-gén az Agrobacterium CP4 törzséből – mely a glyphosate hatóanyaggal való szelekciót teszi lehetővé, továbbá, NOS 3′ terminátor, mely transzkripciós terminátorként funkcionál, és irányítja a poliadenilációt.

Fentiek mellett mindkét vektor tartalmaz bakteriális elemeket, annak érdekében, hogy a vektorokat nagy mennyiségben tudják termelni Escherichia coli sejtekben. Ezen elemek: ori-pUC, mely felelős a bakteriális sejtben történő átíródásért, LacZ gén, mely az elkészült vektorok szelektálását segíti elő kék-fehér szelekció segítségével, továbbá kanamicin-rezisztenciagén, mely az E. coli K12-as törzsének Tn5-ös transzpozonjáról származó neomicin-foszfotranszferáz II gén.

A MON 810-es kukorica előállítására a génpuskán vagy génágyún alapuló biolisztikus módszert alkalmazták. A MON 810-as kukorica előállításához egy közép-amerikai törzset, a Zea mays ssp. mays típust, választották. Maga a génbevitel módszere igen egyszerű, lényegében a sörétes puska elvén alapszik. A vektor DNS-t egy nehézfém (arany, wolfram) mikrohordozóhoz kötik. A mikrohordozót egy makrohordozóhoz rögzítik, majd nagy sebességre gyorsítják, ezt követően azt hálónak/rácsnak ütköztetik, amin fizikilag szóródik (diszpergálódik) a vektor DNS-sel bevont mikrohordozó. A rácsnak ütközést és az így fellépő szóródást követően a nagy sebességű DNS-sel burkolt mikrohordozó a kezelni kívánt mintát tartalmazó Petri-csésze felé repül. Az ezen Petri-csészén található növényi szövet- vagy sejttenyészet érintett sejtjeinek sejtfalát átlyukasztva a DNS a mikrohordozóval együtt a sejtbe jut. Az esetek kis részében a vektor DNS eljut a sejtmagba, és ott létrejöhet a genomba történő integrálódás [Hill et al 2005]. A transzformációt követően a transzformánsok analízise következik, vagya cry1Ab gén genomba épülésének visszaigazolása. Ez legtöbb esetben a cry1Ab génre vagy géntől 5′ vagy a géntől 3′ irányokba tervezett specifikus primerekkel és genomanalízissel végzik el [Hernandez et al 2003]. Továbbá Southern-hibridizációt is számos esetben alkalmaznak a genetikai módosítás visszaigazolására. A MON 810-es kukorica genomanalízise során visszaigazolták, hogy csak a PV-ZMBK07 vektorról származó konstrukció épült be.

A transzformálás maga is számos veszélyt rejt magában, ami a genom instabilitásában nyilvánulhat meg. A kukorica genomja megközelítőleg 25%-ban tartalmaz ugráló genetikai elemeket (transzpozonokat), melyek akár kromoszómák között is mozoghatnak, ezek segítségével akár a transzgén vagy a transzgén promótere is átkerülhet más kromoszómára. Emellett a transzgén random módon, tehát nem előre meghatározott helyre épül be a genomba, ezáltal más gén/gének átíródását is megváltoztathatja. Így akár egy-egy fontos fehérje expressziója is gátlódhat, melyeket ez esetben alternatív úton kell a sejtnek megtermelni, ami előre kiszámíthatatlan változásokat okozhat a sejtben. Ellenkező esetben olyan gének, alvó gének, aktiválódhatnak, melyekre a növények nincs szüksége. Továbbá a tripletek leolvasási kerete is eltolódhat beépülés hatására (frame shifting), mely teljesen más aminosavak szintéziséhez vezethet.

Termesztés során szembe kell néznünk a gének – fizikai vagy biológiai – megszökésének veszélyével [Heszky 2006], vagyis a kukorica pollenje akár nem GM növényeket is megtermékenyíthet, így fajtahibrideket létrehozva, ezáltal veszélyeztetve a hagyományos és biogazdálkodást, a vetőmagtermesztést és a kukorica génbankját. A GM kukoricafajták előállítása, az erőteljes szelekció magában hordozza a génerózió lehetőségét is.

A MON 810-es kukoricát toxintermelésének sajátosságai miatt is vitatják. Mivel az új transzgenikus sejtvonalban a Cry1Ab toxin termelődése egy konstitutív promóter (CaMV 35S) irányítása alatt áll, minden egyes sejtben termelődik toxin, ezáltal nagyságrendekkel magasabb is lehet az egy hektáron termelődő toxinmennyiség a hagyományos biológiai növényvédő szeres védekezés során kijuttatott Dipel mennyiségének [Székács és Darvas 2007]. A toxin termelődése eltérő az egyes növényi részekben és termesztési időszakokban. A kukoricamoly hernyója a kukorica föld feletti részeit tudja károsítani, a szárban vagy csőben készített aknákkal, amelyek a szár eltörését okozhatják, vagy a csőben utat nyitnak a különböző gombabetegségeknek, mint például a Fusarium-fajok által okozott betegségeknek [Darvas et al 2011]. Annak ellenére, hogy a védekezésre főként a növényi szárban és a csövekben lenne szükség, a növény folyamatosan minden részében termeli a Cry1Ab toxint. Intenzív toxintermelés tapasztalható már a csírázás folyamán a magban, majd ezt követően a levélben az első hónap végéig. A toxintermelési maximumot ekkor éri el a növény, ami 17,15 ± 1,66 μg toxinszintet jelent 1 gramm friss növényi szövetben. A levélben ezt követően csökkenés figyelhető meg a toxinszintben, amit ismételt növekedés követ. Hasonló toxintermelési ingadozások figyelhetőek meg a gyökérben. A toxinkoncentráció minden növekedési/fejlődési fázisban a levélben a legmagasabb, mely nem a kukoricamoly hernyójának fő tápláléka. Ezt követi a portok, majd a gyökér, a szár, a kukoricaszem és végül a pollen. Vagyis a ténylegesen károsított szárban közepes mennyiségű toxin termelődik [Székács et al 2010]. A kukorica szemtermése, amit akár emberi fogyasztásra termesztenek (hangsúlyozottan Románia, Olaszország), nagyon kis mennyiségű toxint tartalmaz, viszont a növény levelét, melyben legnagyobb mennyiségben termelődik meg a toxin, sok esetben állati takarmányként hasznosítják (silózás).

Végül, de nem utolsósorban meg kell említeni a tarlómaradványok problematikáját. A tarlómaradványokban az ősszel mérhető toxinmennyiség 1-8%-a mérhető egy év múlva [Székács és Darvas 2007]. Így a betakarítást követően a földeken maradt növényi maradványok hatással lehetnek a talajélet szempontjából igen jelentős, a lignocellulóz dekompozícióját végző talajfaunára is, amire a kukorica talajbeli maradványait fogyasztó ugróvillások vizsgálatai irányították rá a figyelmet [Bakonyi et al 2006, 2011].

Irodalomjegyzék

• Bakonyi G, Szira F, Kiss I, Villányi I, Seres A, Székács A(2006) Preference tests with collembolas on isogenic and Bt-maize. Eur J Soil Biol 42, 132-135.
• Bakonyi G, Dolezsai A, Mátrai N, Székács A (2011) Long-term effects of Bt-maize (MON810) consumption on the Collembolan Folsomia candida. Insects 2, 243-252.
• Bravo A (1997) Phylogenetic relationships of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin family proteins and their functional domains. J Bact 179, 2793-2801.
• Darvas B, Székács A (2010) A géntechnológiai úton módosított növények megítélése az Európai Unió keleti határán. Biokontroll 1, 13-23.
• Darvas B, Bánáti H, Takács E, Lauber É, Szécsi Á, Székács A (2011) Relationships of Helicoverpa armigera, Ostrinia nubilalis and Fusarium verticillioides on MON 810 maize. Insects 2, 1-11.
• Hernandez MP, Esteve T, Prat S, Puigdomenech P, Ferrando A (2003) A specific real-time quantitative PCR detection system for event MON 810 in maize YieldGard based on the 3′- transgene integration sequence. Transgenic Res. 12, 179-189.
• Heszky L. (2006) A koegzisztencia jelenlegi formája szakmailag megalapozatlan, a gyakorlatba kivitelezhetetlen. Mag Kutatás, Fejlesztés és Környezet 20 (5-6), 14-15.
• Hill M, Launis K, Bowman C, McPherson K, Dawson J, Watkins J, Koziel M, Wright MS (1995) Biolistic introduction of a synthetic Bt gene into elite maize. Euphytica 85, 119-123.
• Ho M, Ryan A, Cummins J (1999) Cauliflower mosaic viral promoter – a recipe for disaster? Microbial Ecol. Health Disease 11, 194-197.
• Székács A, Darvas B (2007) A MON 810-es kukorica Cry1 toxintermelése és annak tarlómaradványokban való lebomlása. 27-30 oldal In. Darvas B. (szerk.) Mezőgazdasági géntechnológia – Elsőgenerációs GM-növények. Magyar Országgyűlés Mezőgazdasági Bizottsága, Budapest. (ISBN 978 963 87505 1 8)
• Székács A, Lauber É, Juracsek J, Darvas B (2010) Cry1Ab toxin production of MON 810 transgenic maize. Environ Toxicol Chem 29, 182-190.
• Takács E, Lauber É, Bánáti H, Székács A, Darvas B (2009) Bt-növények a növényvédelemben. Növényvédelem 45, 549-558.

Baka Erzsébet
(bioKontroll Folyóirat 2011. szeptember)